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Collagenase, TypeI 膠原酶I型

消化法中常使用的酶有3種：胰蛋白酶、膠原酶以及透明質酸酶，透明質酸酶多數(shù)情況下與胰蛋白酶或膠原酶聯(lián)合應用；胰蛋白酶作用較強，容易造成平滑肌細胞損壞；膠原酶作用較緩和，能消化細胞間質中的膠原纖維以釋放細胞，對細胞損傷小，是*一種可以降解具有三股超螺旋結構的天然膠原纖維的蛋白酶。

膠原酶(Collagenase)從溶組織梭菌（Clostridium histolyticum）提取的一種酶粗提物，也叫梭菌蛋白酶A（clostridiopeptidase A），不僅含有膠原酶，還含有其他的一些蛋白酶、多糖酶、脂酶等。這些成分分別能夠有效水解結締組織和上皮組織細胞外基質內的其他蛋白，多糖和脂質。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，既操作簡便又可提高細胞成活率，zui終濃度200u/mL，此酶消化作用緩和，無需機械振蕩。

目前商業(yè)化提供的細菌膠原酶主要根據(jù)膠原酶活性的差異，分為四種類型：膠原酶I型，II型，III型和IV型，在應用上有所偏向：1）膠原酶I（Type I Collagenase）：含有比較均勻的各種酶活力（包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性）。通常用作上皮細胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細胞的制備；2）膠原酶II（Type II Collagenase）：含有更高的梭菌蛋白酶活性，通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來源細胞的制備；3）膠原酶III（Type III Collagenase）：含有較低的蛋白酶活性，常用于乳腺細胞的制備；4）膠原酶IV（Type IV Collagenase）：含有低胰酶活性，通常用于胰島細胞的制備，或者需要維持受體完整性的細胞制備實驗。

使用方法

1. 膠原酶儲存液的配制

向每管100mg的膠原酶中加入100µL的含Ca2+、Mg2+的HBSS（Hank’s平衡鹽溶液，含Ca2+、Mg2+），輕輕旋渦震蕩使其充分溶解，制備成1g/ml（即1000×）的儲存液。然后用低蛋白結合性的0.22μm的濾膜過濾除菌，分裝成小份量，然后于-20℃避光凍存。

使用前于冰上解凍，避免反復凍融。其用于組織和細胞分散的常用濃度為：0.5-2.5mg/ml，用于軟骨消化的常用濃度為1-2mg/ml，需要根據(jù)特定的實驗條件或者參考相應的文獻資料確定所需的*工作濃度。

2．組織的分離

1）使用無菌手術刀或剪刀將組織切成3-4mm大小的組織塊；

2）利用含Ca2+、Mg2+的HBSS洗滌組織塊數(shù)次；

3）加入足量的含Ca2+、Mg2+的HBSS，使其浸沒組織塊，并加入膠原酶至需要工作濃度；

4）于37℃孵育4-18h。消化時使用水平搖床以及用3mM的CaCl2補充消化可以提高消化效率。

5） 已分散開的細胞可使用不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩篩得，收集備用。未*解離的組織另外添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃繼續(xù)孵育；

6）利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細胞數(shù)次；

7）細胞培養(yǎng)液重懸上述細胞，利用自動細胞計數(shù)器或其他方法計算活細胞密度。

8）于細胞培養(yǎng)皿上利用合適細胞培養(yǎng)基接種細胞。

3． 器官灌注

1）向37℃預熱的含Ca2+、Mg2+的HBSS中加入膠原酶，另添加3mM的CaCl2有助于提高分離效率；

2）按照已優(yōu)化的速率對相應的器官灌注膠原酶工作液；

3）將上述過程中回收的灌注液流經(jīng)不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩，從而將已解離的細胞或小片段組織塊與較大團塊分離開來，未充分解離的組織需利用新鮮膠原酶工作液于37℃進一步孵育；

4）利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細胞數(shù)次；

5）細胞培養(yǎng)液重懸上述細胞，利用自動細胞計數(shù)器或其他方法計算活細胞密度。

6）于細胞培養(yǎng)皿上利用合適細胞培養(yǎng)基接種細胞。